液体菌种制作的关键技术

近年来，利用液体菌种食用药用菌已成为一种发展趋势。这项技术已经有人掌握了，但是很多人对这项技术还缺乏深入的了解。他们在理论上无法理解，更不用说在实践中了。根据经验，一些食用菌工厂化生产企业和规模化菌种养殖场正在涉足液体菌种生产，但因技术或设备原因失败的不在少数，部分大企业已成功使用。笔者根据近几年液体菌种制作实践总结出液体菌种制作的关键技术，以供参考。 1、设备问题国内生产液体应变设备的厂家很多，有的可操作性高，有的可操作性差。通常，技术不熟练的用户很容易失败。根据我们多年液体菌种指导经验，一套好的设备必须有良好的空气过滤系统、灵敏的温控系统、快速冷却系统、断电保护装置、高压整理坦克。空气过滤系统应由粗滤器、气泵、总滤器和3-4个精滤器组成。 3~4级过滤器应能耐高温高压，易于灭菌。呼吸器还设计用于承受高温和高压。温度控制系统必须有温度控制仪表和传感器，以及配套的电热管或气源。降温装置应迅速降温，进入下一阶段时温度降至28以下。 2、培养基问题2.1 食用菌培养基中养分浓度和养分浓度比例合适时，才能很好地管理食用菌的生长。养分浓度过低，不能满足食用菌正常生长的需要；养分浓度过高，不仅会造成浪费，还会因渗透压过大而抑制或杀死食用菌的生长。同样，培养基中各种营养物质的比例关系是影响菌丝体生长繁殖、代谢产物形成和积累的重要因素。在各种养分的比例中，最重要的是碳源和氮源的比例。即碳氮比，如果碳源不足，细菌容易老化自溶；氮源不足，菌丝生长过慢，但碳氮比过小，食用菌又容易因氮源过多而过度生长，不利于代谢产物的代谢。积累。 2.2 必须有合适的碳源和氮源。需要根据菌种调整合适的pH值，并有合适的粘度。不同菌株对碳源的需求和利用不同，但大多数药用真菌都能利用葡萄糖、麦芽糖、蔗糖和淀粉。例如，香菇最好的碳源是蔗糖和红薯淀粉。最好的氮源是酵母膏、豆饼粉，其次是蛋白胨。香菇生长期最好的氮源是复合氮源。配比为：豆饼粉：酵母膏：蛋白胨=1：1.5：0.2。 2.3 不同菌株的适宜pH范围不同。通常，调节PH值有以下几种方法： 准备合适的培养基，将培养物的初始pH值调整到合适的范围内，使其具有良好的缓冲能力。 酸碱调节剂如Caco2，或在培养过程中在非营养基质中加入氨水或生理酸性物质。 PH控制与代谢调节相结合，通过饲养控制PH。 2.4 培养基粘度越大，菌球越小，菌毛越短。但粘度不宜过大。在培养过程中，接种量越大，菌丝球越小。当接种量大时，通常可以分散生长，而接种量小则有利于菌丝球的形成。搅拌速度快、风量大时，菌球小；搅拌速度慢、风量小时，菌球直径大。 3、液体菌种的生长繁殖规律食用菌液体菌种的生长分为四个阶段，即滞后期、指数生长期、稳定期和衰退期。 3.1 滞后期。其特点是生长速率常数等于零，细胞体积增长较快，细胞内储存物质逐渐消耗，DNA和RNA含量相应增加，分裂缓慢，新陈代谢活跃。在此期间，细胞在生理上和物质上为下一阶段的快速生长和繁殖做准备。滞后期的长度随菌株、年龄和培养条件而变化。 接种龄，即接种物的生长期，处于生长期的哪个阶段。当菌株处于指数生长期时，后代培养材料的滞后期较短。处于滞后或垂死阶段的后代培养物具有长期滞后阶段。稳定生长期培养的滞后期介于上述两者之间。 接种量，接种量的大小可显着影响滞后期的长短，接种量越大，滞后期越短。 培养基成分富营养滞后期短，反之则滞后期短。 3.2 指数生长期。将液体摇瓶种子引入发酵罐中适应一段时间，即进入指数生长期。这一时期的特点：生长速度最大，一次细胞分裂所需的世代时间（G）较短，细菌的大小、形状和生理特性比较一致，酶系统活跃，新陈代谢快生机勃勃，活菌数接近细菌总数。 3.3 稳定期。随着细胞的不断生长繁殖，培养基中的营养物质逐渐消耗，形成代谢产物，使细胞的生长速度逐渐降低。此时细胞的生长速率等于死亡率，即生长速率常数为零。细胞总数达到最高点。这称为稳定生长期。这一时期的特点是：活菌数稳定，细菌总数达到最高水平，代谢产物的合成和积累为主，代谢积累达到最高值。 3.4 下降期。对于已经达到稳定生长期的菌群，由于营养不足，种群内的细胞死亡率逐渐升高，以致死菌数超过新菌数，活菌数增加。人口减少，呈现“负增长”曲线。此期特点：菌体形态、大小异常，甚至变形，菌体自溶。 4 不同发酵阶段的培养条件4.1 缩短滞后期的措施和培养条件。在指数生长期的种龄接种；适当增加接种量，最高可达20%以上。使用更丰富的介质。最佳栽培条件：大多数食用菌的栽培温度为24~27，低罐压0.015~0.025Mpa，少通风。 4.2 指数生长期的培养条件。通风较大，培养温度为23~24，罐内压力为0.025~0.045Mpa。 4.3 稳定期培养条件。现阶段，如果菌种急用，可直接使用。如果条件有限，可采取降温措施，适当通风，稳定罐内压力。温度22~23，罐压0.03~0.04Mpa。 4.4 衰退期控制措施。尽量低温培养，适时结束发酵。少量通风，降低罐内压力。 5、发酵罐排空及培养基实际排空5.1发酵罐排空。主要利用高温高压蒸汽对空气过滤器、输液管路、呼吸器等部位进行灭菌。一般压力达到0.11Mpa，温度达到121，时间为40分钟。在此过程中，需要不断地轻微放气，以防止杀菌死角和冷凝水。灭菌完成后，系统应保持正压。 5.2 培养基。培养基实消就是在罐压0.11~0.14Mpa，温度121℃以上，灭菌40min对培养基的灭菌，结束后保持罐压在0.02~0.04Mpa。同试管制作灭菌方法一致。     6.检查污染     6.1检查方法。采用先闻后看再取样的方法检查污染情况。培养二天后可以闻尾气味道。正常是无异味。细菌污染有酸味，异味，霉菌污染有酒味。菌丝球增加较快为正常。不增加有可能污染了杂菌。可在接种后第4天取样，在火焰保护下，通过取样阀门，将样液取到无菌瓶内。再在超净工作台上，将样液接入空试管培养基上。于32度条件下培养24h，观查有无细菌等感染。     6.2污染原因。造成污染的主要原因有①种子有杂。②接种时压力回零进了气。③培养基灭菌不彻底。④空气系统消毒不好。⑤泡沫冒顶。⑥蛇管穿孔。⑦接种管穿孔。⑧阀门泄漏。⑨操作失误。     6.3染菌分析。     6.3.1大批量发酵罐染菌，在生产中，不同罐批都出现染菌，而且是同一种杂菌，这时应考虑空气系统出了问题。可能是过滤器失效造成的。     6.3.2个别发酵罐染菌，原因阀门渗漏、发酵罐管件有死角、过滤介质失效。 6.3.3从染菌时间分析。发酵罐早期染菌可能是种子带杂或设备灭菌不彻底。发酵中期或后期染菌可能是中间补料或设备渗漏及操作失误有关。 6.3.4从染菌类型分析  如污染球菌、杆菌或酵母菌等可能因为蒸汽的冷凝水或空气系统泄漏。污染霉菌大多是灭菌不彻底，因为泡沫的增多，泡沫中的空汽和泡沫的薄膜有隔热作用，不易把耐热细菌杀死。一旦泡沫消泡，这些细菌造成污染。     7.发酵终点的确定     确定发酵结束，开始利用的时间要根据生产计划和菌龄来确定，菌种成熟的主要指标是，菌丝体形态成为多而小的菌丝球，发酵结束取样时PH值不致过低。放置10分钟，发酵液与菌丝球不分层，菌丝球呈悬浮状，密度较大，发酵液变清即可开始应用。